Allgemeine Hinweise zu Präparationstechnik und Schnittartefakten

Hinweise zu Methoden und Präparationstechnik

Vollflächige histologische Schnitte, wie sie hier im HistoATLAS zu sehen sind, weisen immer wieder Strukturen und kleinere Defekte auf, die auf die Präparationstechnik zurückzuführen sind. Die unterschiedlichen Materialeigenschaften der Gewebe führen dazu, dass es beim Schneiden zu Falten, Rissen oder Spalträumen kommt. Beim Färben können Farbstoffkristalle im Gewebe hängen bleiben, es können ungleichmäßige Färbungen auftreten, es können kleine Luftblasen beim Eindecken entstehen, beim Digitalisieren können Regionen unscharf dargestellt sein oder man sieht die Grenzen der einzeln aufgenommenen Sehfelder. Solche Artefakte lassen sich nicht grundsätzlich vermeiden, sondern nur durch größte Sorgfalt bei der Herstellung und Auswahl der Schnitte reduzieren. Für die Diagnostik oder die wissenschaftliche Auswertung sind viele Artefakte vernachlässigbar, sofern nur einzelne Regionen betroffen sind, aus Qualitätsgründen sind natürlich auch wir bestrebt hier nur optimale Schnitte zu zeigen. Oft muss aber bewegt man sich auf einem schmalen Gart von Qualität und Machbarkeit.

Die Histologie ist damit eine der wissenschaftlichen Disziplinen aus der Biologie und Medizin, in der die Methodenabhängigkeit der Ergebnisse besonders zum Tragen kommt und offensichtlich ist. Während die Ergebnisse vieler Forschungsdisziplinen oft als "Tatsachen-Erkenntnisse" missverstanden werden, ist in der Histologie sehr einfach erkenntlich, dass schon bei der Art der Probennahme, der Fixierung, der Infiltration der Gewebe und der Färbung, das Ergebnis maßgeblich beeinflusst wird. Jede Fixierung ist eine chemische Reaktion, bei der die Gewebe zwangsläufig verändert werden. Es kann also niemals der "natürliche Zustand" konserviert werden, sondern immer nur ein kontrolliert veränderter Zustand. Dabei ist es gleichgültig, ob eine Gewebeprobe mit Formalin oder Alkohol fixiert wird, ob sie tiefgefroren wird oder ob spezielle Fixative mit Quecksilber oder Kaliumdichromat zum Einsatz kommen. Das Gewebe wird bei der Fixierung chemisch verändert.

Die folgenden Prozesse der Entwässerung, der Infiltration mit Paraffin und schließlich der Färbung und sogar die Wahl des Mikroskopes und der Beleuchtungseinrichtungen legen fest, was am Ende herauskommt. Nur wenn Kernfarbstoffe verwendet wurden, lassen sich Zellkerne untersuchen, nur wenn Faserfarbstoffe eingesetzt wurden, sind Gewebefasern zu erkennen. Jede Färbung, jede Behandlung und Fixierung bestimmen die Ergebnisse.

Weitere Einflüsse kommen hinzu aus dem Prozess des Schneidens, der Temperatur, der Härte des Paraffins, etc. Zerstörungsfreie Schnitte sind kaum oder nur sehr selten zu bekommen. Die Fixierung hat die Gewebe oft in einer Art verändert, dass sie beim Schneiden oder beim späteren Strecken Risse bekommen. Kleine Scharten am Messer führen zu Rissen oder leichten Kratzern im Schnitt. Oft sieht man diese erst später im Mikroskop, oder sie müssen als solche Artefakte gedeutet werden.

Artefakte

Falten im SchnittFokussierungsproblem bei der AufnahmeRisse im Schnitt durch MesserscharteProblem beim Zusammenfügen von EinzelaufnahmenÜberstreckung beim Aufziehen auf den Objektträger

Artefakte in der Histologie sind solche Strukturen im histologischen Schnitt, die nicht originär dem Gewebe und dessen Aufbau zugeordnet werden können. Man unterscheidet:

  • Fixierungsartefakte
  • Infiltrationsartefakte
  • Schnittartefakte
  • Färbeartefakte
  • Einbettungsartefakte
  • Mikroskopie-/Digitalisierungs-Artefakte

Den qualitativ optimalen Schnitt in der Histologie gibt es nicht! Jedes Präparat, jeder Schnitt weist an der einen oder anderen Stelle Artefakte auf, sei es in Form von Schneideartefakten, Faltungen oder Stauchungen oder ungleichmäßige Färbungen. Auch wenn durch streng reglementierte Präparationsverfahren solche Artefakte in Grenzen gehalten werden, so sind sie niemals ganz auszuschließen.

Die vollflächige Digitalisierung birgt ein weiteres Problem: Während man am Mikroskop einen Schnitt nur Ausschnittsweise betrachtet und hierbei natürlich diejenigen Regionen aufsucht, die von guter Qualität sind, zeigen ganzflächige Digitalisierungen natürlich auch all diejenigen Regionen, die von minderer Qualität sind.

Schnitte sind desweiteren gerade bei hohen Vergrößerungen niemals vollflächig fokussiert, sondern immer nur in der jeweiligen Fokusebene scharf. Das führt dazu, dass trotz höchstem technischen Aufwand immer wieder Bereiche auftreten, in denen der Fokus nicht optimal ist. Moderne Systeme versuchen dies durch die Verrechnung von Bildern, die in mehreren Fokusebenen aufgenommen wurden, zu kompensieren. Jedoch sind hierzu enorme Rechenleistungen der Computer notwendig.

Ein weiteres Problem ist die Zusammensetzung der ganzflächigen Schnittbilder. Auch die automatische Digitalisierungseinrichtung setzt einzelne Sehfelder zusammen, indem die Randbereiche der Bilder möglichst deckend übereinandersetzt werden. Dass dies nicht immer einwandfrei funktioniert hat verschiedene Gründe, zum einen ggf. abweichende Fokusebenen oder Gewebestrukturen, die vom Computer nicht eindeutig zusammengefügt werden können.


Schnittartefakte sind i.d.R. am leichtesten zu erkennen, da es sich um offensichtliche Defekte im Gewebe handelt, wie z.B. Streifen durch Messerscharten oder Risse und Löcher im Gewebe, die beim Schneiden oder Strecken entstanden sind. Die Ursache von Schnittdefekte ist nicht immer der Schneideprozeß, sondern oft die Fixierung bzw. Infiltration. So werden weiche, wasserhaltige Gewebe mit nur wenig Bindegewebe (Leber, Niere, Hirn) durch Formalin oft sehr stark verhärtet, so dass ein zerstörungsfreier Schnitt nahezu unmöglich ist. Das Gewebe weisst oft Risse aus Ausbrüche auf, die durch die Härtung beim Fixieren bedingt wurden, jedoch erst beim Schneiden auftreten.

Schwieriger zu erkennen sind chemische Artefakte der Fixiermittel. So ist es beispielsweise bei quecksilberhaltigen Fixiermitteln zwingend notwendig, dass die Schnitt mit Jodjodkalium-Lösung (Lugol'sche Lösung) und Natriumthiosulfat nachbehandelt werden, da ansonsten kleine schwarze Kristalle im Schnitt auftreten können. Ohne zu wissen, wie fixiert wurde, könnte der Betrachter diese als dem Gewebe zugehörig interpretieren.

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