Fixieren, Einbetten und Schneiden

Probennahme und Fixieren

Am Anfang jeder histologischen Bearbeitung stehen Probennahme und Fixieren. In vielen Fällen der biologischen Forschungs- und Lehrmaterialbearbeitung werden wohl ganze Tiere fixiert werden, wenn es sich um kleine Organismen von wenigen Millimetern bis wenigen Zentimetern Größe handelt. Bei größeren Tieren, oder gar in der medizinischen oder pharmazeutischen Forschung sind Biopsien die typischen Gewebeproben. Nur in Einzelfällen werden heutzutage noch ganze Organe oder ganze Tiere histologisch verarbeitet. Der histologische Längsschnitt durch ein Elefantengehirn, eine menschliche Leber oder ein Herz oder gar der Totalschnitt einer Ratte sind Ausnahmen, die zwar möglich sind, jedoch einen hohen Arbeits- und Bearbeitungsaufwand bedeuten.

Dieser erste Arbeisschritt der Probennahme und Fixierung der kritischste, da mit der Entnahme der Probe aus dem Gesamtorganismus bzw. mit der Betäubung oder Tötung des Tieres, die Selbst-Versorgungs- und Selbst-Erhaltungsaktivitäten der Zellen und Gewebe  gestoppt werden. Enzymaktivitäten und Zersetzungsvorgänge jedoch laufen weiter, so dass just in dem Moment, in dem die Biopsie aus dem Körper entfernt wird, das Gewebe sich zu zersetzen beginnt.  Es sind autolytische Prozesse der Enzyme, Zersetzungsvorgänge von Bakterien und allgemeiner Zerfall von Proteinen, der unmittelbar zur Gewebeveränderung führt. Somit ist eine schnelle Fixierung das Maß aller Dinge in der Histologie; je schneller die Biopsie mit dem Fixiermittel durchtränkt wird, desto besser ist de Qualität der Erhaltung.

Perfussion und Immersion-Fixierung

Die beste Erhaltungsqualität wird immer die Perfussionsfixierung liefern. Hierbei macht man sich das Gefäßsystem des Organismus selbst zu Nutze. Bis in die entferntesten Regionen hinein ist der Körper von feinen Blut- und Lymphgefässen durchzogen. Wenn über eben dieses Gefäßsystem das Fixiermittel in allen Regionen des Körpers bzw. der zu nehmenden Probe verteilt werden, so liefert dies die besten Fixierergebnisse, einerseits weil hierdurch eine feine Durchdringung erreicht wird, andererseits, weil die Versorgungsfunktionen erst in dem Moment gestoppt werden, wo die Fixierflüssigkeit die betroffenen Geweberegionen erreicht. Die Perfussionsfixierung ist damit die aufwändigere Variante der Fixierung, führt aber zu den besseren Ergebnisse. Im ersten Schritt muss ein Tier betäubt und das gewünschte Organ bzw. die zentralen Blutgefäße freigelegt werden.  An die Gefäße werden dann Kanülen angeschlossen und zunächst mit einer Pufferlösung das Blut ausgespült. Anschließend erst wird die Fixierlösung eingespeist und im optimalen Fall sogar vom noch schlagenden Herz durch den Körper gepumpt. 

Dieser operative Eingriff darf nur von geschultem Personal durchgeführt werden und für viele Wirbeltiere ist zudem eine besondere Genehmigung erforderlich, solche Eingriffe vorzunehmen. Die Perfussionsfixierung sollte aufgrund des Aufwandes nur dann gewählt werden, wenn es für die Qualität der Präparate absolut unumgänglich ist.

Die Immersionfixierung hingegen beruht auf einer Durchdringung des Gewebes von außen; das Fixativ diffundiert also in das Gewebe hinein und fixiert es dabei. Für eine Immersionsfixierung genügt es, ein Gewebestück aus dem Organ zu entnehmen und dieses dann in ein Gefäß mit der Fixierlösung zu geben. Zu Beachten ist hierbei vor allem die Größe der Probe und die Art und Weise, wie die Bio-psie aus dem Gewebeverbund entnommen wird. Stumpfe Skalpelle sollten hier niemals verwendet werden, weil hierdurch das Gewebe gequetscht wird, ebenso sollten die Proben nur in derjenigen Größe genommen werden, wie es maximal notwendig ist. Je größer hier die Oberfläche im Verhältnis zum Gewebevolumen, desto besser die Fixierung. Ein flaches, breites Gewebestück wird schneller und besser fixiert als ein würfelförmiges Stück vom gleichen Volumen.

Für Immersionsfixierungen gilt, dass mindestens das 10-20fache Volumen des zu fixierenden Gewebestückes vorliegen sollte, um eine gute Durchdringungen zu erreichen. Auch ist zu bedenken, dass die Fixierung eine chemische Reaktion ist, und demzufolge das Fixiermittel bei der Fixierung verbraucht wird. D.h., dass es je nach Größe der Gewebeproben sinnvoll sein kann, die Fixierlösung nach einiger Zeit zu wechseln, damit die Fixierreaktion vollständig und in guter Qualität stattfinden kann.

Auswahl der Fixiermittel

Die Wahl des Fixiermittels ist ausschlaggebend für das Ergebnis. Das Fixiermittel beeinflußt die Schniedbarkeit, die Färbbarkeit, die Erhaltung der darzustellenden Strukturen und die Veränderungen des Gewebes während des Fixiervorganges. Bei stark wasserhaltigen Geweben sind z.B. Schrumpfungungen zu befürchten, bei kollagenarmen Geweben führen manche Fixiermittel zu Verhärtungen, die sich sehr negativ auf die Schneideeigenschaften auswirken. Insgesamt betrachtet gibt es nur wenige universelle Fixiermittel, und auch diese sind immer ein Kompromiss, der niemals alle potentiellen Fragestellungen abdeckt. 

Die üblichen Fixiermittel sind Formalin, Pikrinsäure-Lösungen, Quecksilberchlorid-Lösungen, Kaliumdichromat-Lösungen, Osmium-Lösungen und alkoholische Lösungen. Reine Alkoholfixierungen sind meist unzulänglich, da sie aufgrund der hygroskopische Eigenschaften des Alkohols zu starken Gewebeschrumpfungen führen und vor allem die Zellen stark dehydrieren und schrumpfen lassen. Für genetische Untersuchungen ist die Fixierung in 99,8 %igem, unvergälltem (!) Alkohol jedoch obligatorisch. Sollen Silbernitratfärbungen (des Nervengewebes) durchgeführt werden, sind Quecksilberfixierungen ungeeignet; hier greift auf spezielle Fixiergemische zurück (z.B. Carnoy‘sches Gemisch). Embryonale oder stark wasserhaltige Gewebe fixiert man am besten mit Bouin oder Sublimatgemischen mit hohen Essigsäureanteilen, weil die Essigsäure der Zellschrumpfung entgegenwirkt. Besonders harte Gewebe oder von harten Körperwänden umgebene Biopsien (oder ganze Tiere mit festen Exoskeletten, wie z.B. Arthropoden) erfordern Fixiermittel mit sehr guten Durchdringungseigenschaften, die zugleich leicht entkalkend wirken bzw. chitiniges Material aufweichen. Es ist schwierig bis unmöglich universell gültige Empfehlungen für die Wahl des richtigen Fixiermittels zu geben, dennoch ist Formalin in 4-10 %iger Konzentration das üblichste und am weitesten verbreitete Fixiermittel.

Da alle Fixiermittel ihre Vor- und Nachteile haben, ist es bei Probennahmen für Forschungszwecke sinnvoll, immer mehrere Proben zu nehmen und diese unterschiedlich zu fixieren. In der Praxis ist dies zwar oft schwer umzusetzen (insbesondere bei medizinischen Biospien), eine gute Voraussetzung besteht jedoch, wenn bei wissensschaftlichen Exkursionen im Feld für die Probennahme bereits mehrere Fixiermittel zur Verfügung stehen. Gerade vor dem Hintergrund zunehmender Schwiergkeiten in der Beschaffung von brauchbarem Untersuchungsmaterial ist eine Fixierung allein in Alkohol oder Formol als fahrlässig zu bezeichnen. Grundsätzlich sollten folgende Alternativ-Fixierungen parallel durchgeführt werden, wobei es durchaus genügt in jeder Fixierungslösung 1-2 Proben aufzubewahren:

  • Neutralformol (gepuffertes Formalin, 4 - 6 %, für marine Tiere angesetzt auf Seewasser-Basis)
  • Alkohol 99,8 % (DAB, p.a.-Qualität - für Genetik)
  • Bouin‘sche Lösung


Wenn umsetzbar sind des Weiteren Probenfixierungen in folgenden Fixierlösungen vorteilhaft:

  • Sublimat-Formol, Stieve-Lösung, SuSa (oder anderes Sublimat-Gemisch) für Untersuchungen auf zellulärer und mikrostruktureller Ebene
  • Carnoy‘sches Gemisch (für Nervenfärbungen)
  • Glutardialdehyd in Caccodylatpuffer für TEM-Untersuchungen
  • Zenker, Helly oder andere Kaliumdichromat-haltige Fixierlösung


Bei Sammelexkursionen wird es notwendigerweise die Regel sein, dass die Tiere direkt in die Fixierlösung gegeben werden. Dies ist bei kleineren Organismen meist unproblematisch, da die Fixiermiettel auch sehr schnell zu Tod der Tiere führen. Dennoch ist zu berücksichtigen, dass der Todeskampf eines Wurmes mitunter schon zu Gewebeveränderungen führen kann, d.h. man hat das Tier nicht in einem „normalen“, sondern in einem verkrampften Zustand fixiert. Wenn es z.B. darum geht, die Mikroanatomie zu untersuchen, können Krampfzustände zu falschen Darstellungen führen. Um dies zu vermeiden, sollten die Tiere zunächst betäubt werden, bevor sie in die Fixierlösungen gegeben werden. Gängige Betäubungsmittel für Invertebraten sind:

  • 2-Phenoxyethanol: Mollusken, Echinodermen
  • Chloralhydrat: viele marine Tiere
  • Ethanol 5-10 %ig: viele aquatische Tiere
  • Magnesiumsulfat: Coelenteraten
  • Menthol: Tunikaten
  • Curare, Succinylcholine: z.B. Holothurien
  • Kokain: z.B. Bryozoen


Ergänzend sei hierzu auf das doppelbändige Werk von Piechoki & Händel (2007) hingewiesen. Hier sind für eigentlich alle Tiergruppen geeignete Sammel-, Betäubungs- und Fixierungsmethoden beschrieben. 

Auch wenn durch den sammelnden Wissenschaftler keine oder nur wenige histologischen Untersuchungen durchgeführt werden, so ist doch im Sinne der Aufgabe von Biodiversitätsforschung, Proben nicht nur für taxonomische Zwecke zu fixieren, sondern auch zukünftige Forschungsfragen mit dem gesammelten Material zu ermöglichen. Dies geht jedoch nur wenn entsprechende verschiedene Fixierungen des Materials vorgenommen werden. Auch wenn dies einen erhöhten Aufwand bei der Probenname bedeutet, so läßt sich die Aufgabe großer Biodiversitäts-Zentren als Archive des Lebens doch nur dann erfüllen, wenn mit der Archivierung des Materials möglichst vielen verschiedenen (auch zukünftigen) Forschungsmethoden Rechnung getragen wird. 

Dieser Aufwand der Betäubung und Sammlung entfällt selbstverständlich bei medizinischem Probenmaterial. In der Pharmaforschung werden überwiegend Mäuse, Ratten, Meerschweinchen und andere Versuchstiere verwendet. Die Betäubung und Probennahme darf hier nur von ausgebildetem Personal vorgenommen werden. 

Fixierzeiten

Fixierzeiten dürfen nicht zu lang sein, da es ansonsten zu unerwünschten Reaktionen der Gewebe kommt mit dem Fixiermittel kommen kann. Formol in geringer Konzentration (4 - 5%) ist für eine dauerhafte Aufbewahrung zwar unbedenklich, führt aber zu Gewebeverhärtungen. Hier kann ein Zusatz von Diethylenglycol die Schneidbarkeit (auch nachträglich noch) verbessern. Die meisten Fixiermittel sollten aber nach 24-48 Stunden ausgewaschen und die Präparate, wenn Sie vor der Verarbeitung länger aufbewahrt werden, sollen in 70 %igen Alkohol überführt werden. Beim Überführen aus den Fixier-/Auswaschlösungen in Alkohol immer Alkoholreihen in angemessenen Schritten durchführen (z.B. aus Wasser: 30 % ==> 50 % ==> 60 % ==> 70 %; aus Sublimat: 90 % Alk. ==> 80 % ==> 70 %).  Besonders nach einer Formalinfixierung sollte der Schritt der Wässerung nicht ausgelassen werden.

Chemie der Fixierung

Die chemischen Vorgänge bei der Fixierung sind noch wenig erforscht. In vielen Fällen beruht das Wissen über Fixiereigenschaften vor allem auf Erfahrungswerten. Prinzipiell kann eine Fixierung kann durch Koagulation oder durch Vernetzung der Proteine erreicht werden.

Unter Koagulation (auch Denaturierung oder Gerinnung genannt) versteht man die (irreversible) Zerstörung der Sekundär- und Tertiärstruktur von Proteinen, nicht aber die der Primärstruktur und nicht notwendigerweise die der Tertiärstruktur.  Die hierbei ablaufenden Reaktionen beruhen auf einer Erniedrigung des pH-Wertes (durch Hinzufügen einer Säure). Dabei entfalten sich die Peptidketten, weil die Disulfidbrücken gespalten und Wasserstoffbrücken aufgehoben werden. Es sind aber gerade diese beiden Bindungstypen, die für die dreidimensionale Struktur des Proteins verantwortlich sind. Weiterhin bildet sich zwischen der zugesetzten Säure und den Aminofunktionen der Proteine ein Salz, das zur Stabilisierung der Fixierung beiträgt, da der Abbau der Proteine zumeist über das N-terminale Ende der Peptidkette beginnt. Die Fixierung durch Säurebestandteile eines Fixiermittels zerstören damit die Funktionen der Proteine. Folglich werden autolytische Prozesse in den Geweben gestoppt und die oxidative Selbstzersetzung wird verhindert. Folglich sind die meisten Säuren auch als Fixiermittel einsetzbar, bzw. Fixiermittel sind Fixiergemische, die Säuren enthalten (z.B. Bouinsche Lösung bestehend aus Pikrinsäure, Essigsäure und Formalin).

Das vielleicht wichtigste und bekannteste Fixativ ist in Wasser gelöstes Formaldehyd  (CH2O). Formaldehyd ist ein Gas, das in wässriger Lösung als Formalin bezeichnet wird. Der Handelsname der etwa 37-38%igen gesättigten Lösung ist „Formol“. Zum Fixierung wird Formalin meist in 4-5 %iger oder 8-10%iger Lösung verwendet. In wässriger Lösung liegt Formaldehyd meist als Diol vor:

OH-HCH-OH  

Da Formaldehyd relativ leicht zu Ameisensäure oxidiert werden kann (unter Luftsauerstoff und Lichteinfall), wird das im Handel erhältliche Formol (= 37-38%iges Formalin) durch Calciumcarbonat gepuffert. Des Weiteren neigt Formalin – vor allem in höheren Konzentrationen – dazu, Polymere zu bilden:

OH-(H2CO)nH

Wenn n > 100 wird, fällt das Polymer als weißer Feststoff aus, der als Paraformaldehyd bezeichnet wird. Um diese Ausfällungsreaktion in der konzentrierten (37-38%igen) Formol-Lösung zu minimieren wird der Lösung bis zu 10% Methanol hinzugegeben. 

Wenn für immunhistochemische Arbeiten Fixierlösungen mit einer sehr genauen Konzentration benötigt werden, kann man ausgefälltes Paraformaldehyd (PFA) in der für die gewünschte Konzentration benötigten Menge in heissem Wasser lösen und durch Ammoniak ein gewünschten pH-Wert einstellen (z.B. 7,0); oft wird PFA auch einem Phosphatpuffer (PBS-Puffer) mit eingestelltem pH-Wert in Lösung gebracht und als Fixiermittel eingesetzt.

Für die Fixerungsreaktion des Formalin sind ausschließlich die Monomere verantwortlich. So läuft beispielsweise an der Aminogruppe des Lysin mit Formaldehyd folgende Reaktion ab: 

R-(CH2)4-NH2  +  H2CO  ==>  R-(CH2)4-NH-CH2-OH

Das resultierende Produkt kann nun mit einer weiteren Aminogruppe reagieren:

R-(CH2)4-NH-CH2-OH  + R-(CH2)4-NH2  

==>

R-NH-CH2-NH-R + H2O

Auf diese Weise vernetzt die CH2-Gruppe (Methylen) das Protein und stabilisiert es.

Ein weiteres wichtiges Fixiermittel ist Quecksilberdichlorid (Sublimat: HgCl2). Sublimathaltige Fixiermittel werden immer im sauren Milieu angewendet. Der Fixiereffekt besteht in der elektrostatischen Anziehungskraft zwischen den Aminogruppen (NH2+-Resten des Proteins und dem aus dem Sublimat stammenden [HgCl4]2- - Komplex. In der Nähe des isoelektrischen Punktes kann sich das Sublimat-Molekyl auch direkt mit der Aminogruppe verbinden:

R-NH2-HgCl2

Da sich solche Quecksilberchlorid-Ablgerung störend bei der mikroskopischen Auswertung auswirken, ist es notwendig, alle mit Sublimat-Gemischen behandelten Gewebestücke vor der Färbung mit Jodjodkali-Lösung und Natriumthiosulfat zu behandeln, um diese Niederschläge wieder zu entfernen. Wird diese Nachbehandlung nicht durchgeführt, sieht man im gefärbten Schnitt schwarze Kristalle, ausgefälltes Quecksilberchlorid.

 

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